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实验七、大肠杆菌感受态细胞的制备 .ppt课件简介:
灭菌准备•LB培养基NaCl1gYeastextract0.5gPeptone1gAddH2Oto100ml每组配置50ml过夜培养及继续培养•枪头盒•试管及试管塞过夜培养•5ml离心管储备空白培养基•牙签挑单克隆•注射器、微孔滤膜和过滤器CaCl2过滤除菌实验七、大肠杆菌感受态细胞的制备实验目的：1、了解感受态细胞制备的基本原理；2、掌握CaCl2法制备感受态细胞的基本步骤。•野生质粒：mob基因细菌接合作用•人工构建的质粒载体：缺乏mob基因无法自行进入细菌需要受体细菌转变为感受态实验原理1.感受态细胞：细菌细胞在一定的生长阶段，通过理化方法的诱导，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。细胞密度在5×10个细胞/ml培养液为宜，即OD600=0.4左右。72.CaCl2法处理感受态细胞：快速生长的大肠杆菌置于0℃预处理的低渗氯化钙溶液中，细胞膨胀成球状，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，此时细胞被诱导成为感受态细胞。当将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。注意事项：1.细菌的生长状态和密度：最好直接使用-70℃保存的菌种转接制备感受态的菌液；细胞密度在5×10个细胞/ml培养液为宜，不超过10/ml，即OD600=0.4左右(DH5α菌株)。2.试剂的质量：高纯度，不含去污剂成分783.所有操作均应在无菌条件和冰上进行；4.尽可能把细胞团沉淀打...
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